功能性肽是指具有某種特定生物活性、對(duì)機(jī)體有益的肽類(lèi)化合物，通常由兩個(gè)及兩個(gè)以上的α-氨基酸組成，廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物機(jī)體中，可通過(guò)蛋白質(zhì)降解或人工合成得到。按照來(lái)源可分為內(nèi)源性功能肽和外源性功能肽，其中源于人體自身的肽稱(chēng)為內(nèi)源性功能肽，可參與機(jī)體代謝；而人體之外的、存在于動(dòng)植物和微生物中的肽，以及經(jīng)蛋白質(zhì)降解、氨基酸合成得到的肽則稱(chēng)為外源性功能肽，具有多種有益健康的生理功能。根據(jù)生物活性可以將功能性肽分為抗氧化肽、抗菌肽、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽、抗腫瘤肽、免疫活性肽等。功能性肽分子質(zhì)量較小、細(xì)胞透過(guò)性好、易被人體消化吸收，且毒副作用低，從而受到食品、藥品、醫(yī)療等領(lǐng)域的高度關(guān)注。

       外源性功能肽的分離純化

       肽可用于功能性食品、藥物（抗癌、抗炎等）和化妝品的開(kāi)發(fā)等。通過(guò)蛋白質(zhì)降解或氨基酸合成得到的外源性功能肽是由游離氨基酸、不同分子質(zhì)量的氨基酸組成的肽段、大量無(wú)機(jī)鹽以及未水解蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成的混合物。為了獲得具有特定分子質(zhì)量和氨基酸組成且具有特定功能活性的肽段，必須對(duì)混合物進(jìn)行分離純化?，F(xiàn)階段常用的分離純化方法有電泳技術(shù)、膜分離技術(shù)、色譜技術(shù)以及多種方法聯(lián)用等。隨著肽組學(xué)的研究深入，又出現(xiàn)了一些新型的分離方法及分離材料，例如介孔材料、探針等。

       01、膜分離技術(shù)

       膜分離不同于傳統(tǒng)意義上的過(guò)濾，其可以在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)進(jìn)行肽混合物的精準(zhǔn)分離，是單純的物理作用，具有操作簡(jiǎn)單、不影響樣品活性、適用性強(qiáng)等特點(diǎn)。根據(jù)膜的孔徑大小可以分為微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜等。目前，超濾技術(shù)已經(jīng)普遍用于酶解產(chǎn)物的分級(jí)分離中。膜分離技術(shù)通常作為肽分離純化的第一步，不需化學(xué)反應(yīng)，在常溫條件下進(jìn)行，過(guò)程簡(jiǎn)單，適宜大量混合物的分離。但是一定分子質(zhì)量范圍內(nèi)存在著大量結(jié)構(gòu)相似、質(zhì)量相近的肽段；除此之外，肽的分離純化容易受到脫鹽的影響，膜材料也容易堵塞和污染，不利于資源的回收與利用。因此，對(duì)于肽的分離純化，膜分離技術(shù)的選擇性并不高。

       02、電泳技術(shù)

       用于肽分離的毛細(xì)管電泳有毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管等速電泳、毛細(xì)管等電聚焦、毛細(xì)管凝膠電泳、親和毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管免疫電泳、芯片式毛細(xì)管電泳、陣列毛細(xì)管電泳等。電泳技術(shù)具有分辨率高、分離速度快的特點(diǎn)，但是進(jìn)樣量少、光路短，限制了其在肽分離純化中的大規(guī)模制備及應(yīng)用。

       03、色譜技術(shù)

       色譜技術(shù)是最為普遍的肽分離純化方法。常用的色譜技術(shù)有大孔樹(shù)脂吸附層析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析、反相高效液相色譜法等。

       大孔樹(shù)脂可將吸附和篩選相結(jié)合，利用各組分吸附力和分子質(zhì)量大小不同進(jìn)行分離。大孔樹(shù)脂具有回收率高、選擇性好、分離效率高、吸附條件溫和等特點(diǎn)，廣泛用于色素、多酚、生物活性肽等水溶性化合物的分離提純。

       凝膠過(guò)濾層析能夠分離酶解產(chǎn)物中的活性物質(zhì)，但對(duì)于分子尺寸相近的肽，無(wú)法進(jìn)一步純化。凝膠過(guò)濾的分離效果易受到基質(zhì)顆粒的大小及均勻程度的影響，常與其他分離方法（例如超濾等）聯(lián)用才能達(dá)到最終分離純化的目的。

       采用一種方式對(duì)蛋白質(zhì)、肽等物質(zhì)進(jìn)行分離純化，很難達(dá)生物分析的標(biāo)準(zhǔn)。多種方式聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)肽混合物的精準(zhǔn)分級(jí)分離，以獲得高純度的肽組分。如超濾-凝膠過(guò)濾色譜-高效液相色譜聯(lián)用，離子交換色譜-凝膠過(guò)濾色譜-高效液相色譜聯(lián)用。

       內(nèi)源性功能肽的富集

       通常含有內(nèi)源性功能肽的生物樣品中成分濃度極低（小于1 nmol/L），而且蛋白質(zhì)和內(nèi)源性功能肽的物理化學(xué)性質(zhì)極其相似。因此，內(nèi)源性功能肽在富集過(guò)程中容易受到高含量蛋白及其他復(fù)雜成分的影響，選擇性高效富集低濃度內(nèi)源性功能肽成為生物分析的難點(diǎn)問(wèn)題。按照肽的種類(lèi)，富集方法可以分為糖肽的富集、磷酸肽的富集以及其他小分子肽的富集。

       01、糖肽的富集

       糖基化是重要的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾之一，人體內(nèi)約有一半以上的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生糖基化。糖肽的富集方法主要有凝集素親和法、肼化學(xué)法、硼酸化學(xué)法、親水作用法等。

       凝集素是一種可與多糖結(jié)合的蛋白，是最早運(yùn)用于糖肽富集的物質(zhì)。常用的凝集素材料有選擇性結(jié)合甘露糖的伴刀豆凝集素A、結(jié)合N-乙酰神經(jīng)氨酸單元的接骨木凝集素、與巖藻糖相結(jié)合的橙黃網(wǎng)胞盤(pán)菌凝集素、選擇性識(shí)別N-乙酰葡糖胺的小麥胚芽凝集素等。凝集素親和法的缺陷在于它只能與其識(shí)別的糖型結(jié)合，在選定凝集素的情況下，只有選擇性吸附特定組成的部分糖肽。

       肼化學(xué)法富集糖肽的過(guò)程包括將糖鏈上的順式鄰二醇氧化成醛；醛基與固相支持物上的酰肼基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)。與凝集素親和法不同，肼化學(xué)法可以吸附所有的糖蛋白。

       在堿性溶液中，糖鏈上的順式鄰位和硼酸基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)形成環(huán)狀二酯，從而進(jìn)行糖肽的吸附；在酸性溶液中，發(fā)生堿性溶液中的可逆反應(yīng)，即環(huán)狀二酯水解，從而實(shí)現(xiàn)糖肽的解吸。

       02、磷酸肽的富集

       磷酸化肽的富集容易受到高濃度蛋白的影響，磷酸肽的富集方法主要有親和色譜富集法、離子交換色譜法。磷酸肽的親和色譜法富集主要分為金屬氧化物親和色譜法、固定化金屬離子親和色譜法和金屬有機(jī)骨架法。離子交換色譜主要依據(jù)磷酸肽和非磷酸肽的電荷差異實(shí)現(xiàn)磷酸肽的富集，其中溶液的pH值是影響磷酸肽特異性吸附的重要因素。

       03、其他低濃度度肽的富集

       除了磷酸肽及糖肽，生物體內(nèi)還有多種與生物體代謝及與生理活動(dòng)密切相關(guān)的內(nèi)源性功能肽。納米材料與色譜法聯(lián)用富集內(nèi)源性功能肽，能夠去除復(fù)雜成分和高濃度蛋白的影響，并且能定向提取某種肽類(lèi)。其已經(jīng)成功應(yīng)用于人血清、小鼠大腦提取物及人體其他體液中內(nèi)源性功能肽的富集，但是納米材料不適用于大量的生物分析，且納米材料也不易與樣品分離，造成目標(biāo)肽污染。因此，需要研制出更加快速、高效、易于分離的新型納米材料。

       功能性肽可以用于功能性食品開(kāi)發(fā)、疾病檢測(cè)、美容用品研發(fā)等領(lǐng)域，具有極大的開(kāi)發(fā)利用潛力，成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。功能性肽的深入研究與人類(lèi)健康息息相關(guān)，其分離與富集技術(shù)的優(yōu)化能夠促進(jìn)食品、藥品等行業(yè)的快速發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)需要借助其他領(lǐng)域的新材料、新方法，發(fā)展出便捷、高效、覆蓋面廣的分離和富集方法，才能更便捷、更高效地得到功能性肽，為國(guó)民健康奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

       參考文獻(xiàn)：

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       [2]CHALAMAIAH M, YU W L, WU J P. Immunomodulatory and anticancer protein hydrolysates (peptides) from food proteins: a review[J]. Food Chemistry, 2018, 245: 205-222.

       關(guān)鍵詞：活性肽  分離純化  富集

       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，畢業(yè)于華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)食品的開(kāi)發(fā)與研究。