1953年，沃森和克里克發(fā)表的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型標(biāo)志著分子生物學(xué)的誕生，自此人類有了探索生物起源、進(jìn)化、發(fā)展的新途徑。最重要的是，分子生物學(xué)的應(yīng)用已經(jīng)覆蓋到生產(chǎn)生活、醫(yī)療健康、社會(huì)發(fā)展的方方面面，這一成果也被譽(yù)為20世紀(jì)以來生物學(xué)方面最偉大的發(fā)現(xiàn)。然而，分子生物學(xué)也給社會(huì)帶來一定的負(fù)擔(dān)，安全、倫理、生態(tài)系統(tǒng)等多個(gè)層面都面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)。

       2021年4月15日，于2020年10月中國(guó)全國(guó)人大常委會(huì)審議通過的《生物安全法》正式生效，這標(biāo)志著我國(guó)對(duì)于生物安全監(jiān)管的全面升級(jí)。《生物安全法》以建立生物安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)預(yù)警制度、風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查評(píng)估制度、信息共享制度、信息發(fā)布制度、名錄和清單制度、標(biāo)準(zhǔn)制度、生物安全審查制度、應(yīng)急制度、調(diào)查溯源制度、國(guó)家準(zhǔn)入制度和境外重大生物安全事件應(yīng)對(duì)制度等11項(xiàng)基本制度為基礎(chǔ)，為生物安全管理的全鏈條上了一把鎖。當(dāng)然，《生物安全法》覆蓋的范圍更廣泛，不僅包括生物技術(shù)研究、開發(fā)與應(yīng)用層面，還包括重大新發(fā)突發(fā)傳染病、動(dòng)植物疫情、病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全、人類遺傳資源和生物資源安全、生物恐怖襲擊和生物武器威脅等，當(dāng)下仍在全球范圍內(nèi)肆虐的新冠疫情就是給全世界國(guó)家的一次生物安全"大考"。

       分子生物學(xué)助力食品檢測(cè)

       很多人認(rèn)為生物安全和食品安全是兩個(gè)完全不同的概念，而實(shí)際上二者是交叉關(guān)聯(lián)的關(guān)系，比如對(duì)進(jìn)口冷凍食品新冠病毒的檢測(cè)，既可以認(rèn)為是生物安全的防控措施，也可以認(rèn)為是食品安全的檢測(cè)手段，要知道，對(duì)病原體的檢測(cè)也是食品安全的重要環(huán)節(jié)之一。

       食品原料大來源較為廣泛，但主要是動(dòng)物、植物和微生物等生物制品，因此核酸檢測(cè)、抗體檢測(cè)和抗原檢測(cè)也是食品檢測(cè)常用的幾種方法，由于抗原檢出率較低，通常不會(huì)采用。整體來看，核酸檢測(cè)的應(yīng)用更為普遍，可以囊括絕大多數(shù)生物制品的檢測(cè)，微生物污染、轉(zhuǎn)基因食品、食品摻假等都可以通過核酸檢測(cè)的形式作出鑒定，該技術(shù)被稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。 

       PCR的進(jìn)化

       聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。由于該技術(shù)的發(fā)生依賴于酶的作用，因此1988年Saiki等人在黃石公園溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌中提取到一種耐高溫DNA聚合酶，才真正將PCR技術(shù)變?yōu)榭蓱?yīng)用的現(xiàn)實(shí)技術(shù)。

       PCR需要經(jīng)過變性、退火、延伸三個(gè)過程。首先，一般先于94℃（或95℃）變性3～10min，接著94℃變性30～60；其次，將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，通常在40～60℃之間，時(shí)間為30～45s，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火；最后，再將溫度提升到70～75℃，使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸，延伸時(shí)間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度確定。不斷重復(fù)該過程，可以使目標(biāo)核酸片段迅速擴(kuò)增數(shù)倍，直到滿足檢測(cè)要求。隨著食品行業(yè)對(duì)快速檢測(cè)、操作便捷性、準(zhǔn)確性要求的不斷提升，常規(guī)PCR技術(shù)這種對(duì)溫度要求高、設(shè)備依賴性強(qiáng)的屬性使其很難應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室之外，不能滿足日常的檢測(cè)需要，依托PCR技術(shù)的迭代不斷得以涌現(xiàn)。

       目前的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、鏈替代恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(NASBA)、滾環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RCA)、依賴解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(HDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、鏈替代擴(kuò)增 (SDA)、單引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SPIA)等，其中環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增和重組酶聚合酶擴(kuò)增是最被看好的兩種技術(shù)。

       環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增（LAMP）

       環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增（LAMP）是日本學(xué)者Notomi等在2000年發(fā)表的一種核酸擴(kuò)增的方法，其特征在于使用4種不同的引物專門設(shè)計(jì)用于識(shí)別靶DNA的6個(gè)不同區(qū)域，在鏈置換聚合酶的作用下可以在恒溫條件（60℃-65℃）實(shí)現(xiàn)連續(xù)擴(kuò)增，無需常規(guī)PCR中變性、退火、延伸等步驟，具有反應(yīng)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、硬件要求低等特點(diǎn)。

       目前，該方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于出口食品致病菌的檢測(cè)，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)包括SN/T 2754.1-2011 出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法 第1部分：金黃色葡萄球菌、SN/T 2754.15-2011 出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法 第15部分：阪琦腸桿菌等15項(xiàng)。2020年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布公告第323號(hào)-9-2020環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法制定指南，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)的方法制定做出指導(dǎo)。 

       重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）

       重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。RPA技術(shù)依賴于在常溫下有活性的能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶三種酶，其最 佳反應(yīng)溫度在37℃左右，在常溫下就可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的擴(kuò)增，可以真正的應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。該技術(shù)在出口食品成分的快速檢測(cè)中也較為常用，由于專利等因素的限制，其酶源選擇也不同，也被稱為重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法（RAA法），我國(guó)已制定SN/T 5227-2019 重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法（RAA法）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)11項(xiàng)。

       隨著《生物安全法》的實(shí)施，核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)作為保障生物安全的重要手段必將持續(xù)更新迭代，技術(shù)的延伸應(yīng)用也會(huì)讓食品行業(yè)持續(xù)受益。可以預(yù)見，分子診斷技術(shù)在食品行業(yè)的應(yīng)用將迎來新一輪的擴(kuò)張期。

       關(guān)鍵詞：生物安全法  PCR  核酸擴(kuò)增  基因檢測(cè)

       作者簡(jiǎn)介：慕慕，食品科學(xué)碩士研究生，長(zhǎng)期致力于食品工藝與配方的設(shè)計(jì)與研究，現(xiàn)主要從事肉制品的研發(fā)。