為慶祝第九屆微生物檢測(cè)與控制技術(shù)交流會(huì)召開(kāi)，特此為大家講授乳糖發(fā)酵與ONPG試驗(yàn)。

       各位親，那乳糖發(fā)酵試驗(yàn)與ONPG試驗(yàn)，你有木有傻傻地分不清？還是聽(tīng)額細(xì)細(xì)道來(lái)哈。

       先說(shuō)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)，這是用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌分解乳糖能力的一種生化試驗(yàn)。大家知道，乳糖是葡萄糖和半乳糖這兩個(gè)單糖，通過(guò)糖苷鍵連接而成一種雙糖。而乳糖的分解呢，是乳糖在β-半乳糖苷酶的作用下，糖苷鍵發(fā)生斷裂并產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖。

       這β-半乳糖苷酶是在細(xì)胞內(nèi)的咧，其實(shí)細(xì)菌分解乳糖，一般還需要一種位于細(xì)胞膜上的β-半乳糖苷滲透酶來(lái)參與。這β-半乳糖苷滲透酶的作用嘛，是將細(xì)胞外的乳糖分子主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。所以說(shuō)啊，乳糖發(fā)酵試驗(yàn)可以檢測(cè)兩種酶：β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷滲透酶。

       具有這兩種酶的細(xì)菌，可迅速將乳糖分子主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)跑內(nèi)，在24小時(shí)內(nèi)即可分解乳糖并產(chǎn)酸，導(dǎo)致乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化，表現(xiàn)為乳糖發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性。而缺乏此兩種酶的細(xì)菌，因?yàn)椴荒芊纸馊樘钱a(chǎn)酸，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基不會(huì)變色，乳糖發(fā)酵試驗(yàn)呈現(xiàn)為陰性。還有一些乳糖遲緩發(fā)酵的細(xì)菌，只具備β-半乳糖苷酶，但是由于缺乏β-半乳糖苷滲透酶，乳糖只能通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散緩慢地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)3天以上，才能使乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基變色，表現(xiàn)為乳糖遲緩發(fā)酵。

       至于ONPG試驗(yàn)咧，是用于快速檢測(cè)β-半乳糖苷酶的一種生化試驗(yàn)。與乳糖不同，鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）可迅速進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，ONPG被β-半乳糖苷酶水解后，釋放出黃色的鄰硝基酚（ONP），培養(yǎng)基因此變黃，ONPG試驗(yàn)表現(xiàn)為陽(yáng)性。細(xì)菌若沒(méi)有β-半乳糖苷酶，就不分解進(jìn)入細(xì)胞的ONPG，不能釋放出黃色的ONP，ONPG試驗(yàn)結(jié)果也就為陰性。

       總而言之，不同的細(xì)菌具有不同的酶，乳糖發(fā)酵與ONPG試驗(yàn)可有以下四種結(jié)果。

       甲、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性，ONPG試驗(yàn)陽(yáng)性： 對(duì)于大多數(shù)大腸埃希氏菌，由于同時(shí)具有β-半乳糖苷滲透酶和β-半乳糖苷酶，其表現(xiàn)為發(fā)酵乳糖，ONPG試驗(yàn)也為陽(yáng)性。

       乙、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性，ONPG試驗(yàn)陰性： 對(duì)于普通變形桿菌，β-半乳糖苷滲透酶和β-半乳糖苷酶都木有，其表現(xiàn)為不發(fā)酵乳糖，ONPG試驗(yàn)為陰性。

       丙、乳糖發(fā)酵遲緩陽(yáng)性，ONPG試驗(yàn)陽(yáng)性：對(duì)于亞利桑那菌，雖然具有β-半乳糖苷酶，但缺少β-半乳糖苷滲透酶，其表現(xiàn)為乳糖遲緩發(fā)酵，ONPG試驗(yàn)還是陽(yáng)性滴。

       丁、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性，ONPG試驗(yàn)陰性：有些不動(dòng)桿菌和假單胞菌，β-半乳糖苷滲透酶和β-半乳糖苷酶也都是木有，雖然不能分解乳糖，但是卻可將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸，也能導(dǎo)致乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基變色，表現(xiàn)為發(fā)酵乳糖的假象，由于缺乏β-半乳糖苷酶，其ONPG試驗(yàn)卻是陰性滴。

       親，這乳糖發(fā)酵試驗(yàn)與ONPG試驗(yàn)，你都能分清了吧 ？是不是美滴很，美滴很？不要著急，還有一個(gè)贈(zèng)品呢：下面再說(shuō)說(shuō)ONPG試驗(yàn)的注意事項(xiàng)。

       1、良好的緩沖作用是ONPG試驗(yàn)的關(guān)鍵，所以說(shuō)接種前將那ONPG溶液，在36℃水浴一段時(shí)間，以溶解在儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)生的磷酸鹽結(jié)晶。

       2、細(xì)菌的接種量要大些哈，這樣既可加快反應(yīng)速度，也有利于結(jié)果觀察。

       3、ONPG試劑一般情況下是無(wú)色的，但有時(shí)其中的蛋白胨可致試劑呈輕微黃色，此時(shí)應(yīng)加做陰性對(duì)照予以區(qū)分。

       4、需要提醒的是，ONPG試驗(yàn)不能用于產(chǎn)黃色素細(xì)菌的檢測(cè)，如果懷疑培養(yǎng)基變黃是細(xì)菌產(chǎn)黃色素的緣故，要先離心再來(lái)進(jìn)行結(jié)果判讀。

       5、葡萄糖對(duì)β-半乳糖苷酶有抑制作用，在含乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌，其β-半乳糖苷酶活性也就更高?？傊?，用乳糖含量高的培養(yǎng)基，就對(duì)咧！

       主要參考文獻(xiàn)：

       1、J F MacFadden. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria[M]. Third Edition. Williams & Wilkins, Baltimore, 2000.

       2、Lapage S P, Efstratiou A, Hill L R. The ortho-nitrophenol （ONPG） test and acid from lactose in Gram-negative genera[J]. Journal of Clinical Pathology, 1973, 26（11）：821-825.