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  • 資訊 > 市場動態(tài) > 非洲豬瘟病毒里 基因“針線”繡功了得

    2019-03-19 來源:科技日報(bào)
    日前,我國復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘建華課題組與李繼喜課題組合作,研究解析了非洲豬瘟病毒DNA修復(fù)通路上一種關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究成果在線發(fā)表于《自然·通訊》。

           非洲豬瘟的致死率令養(yǎng)殖場措手不及,侵入豬身體里的病毒為什么可以長驅(qū)直入?有沒有什么辦法能夠阻止它的入侵呢?

           日前,我國復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘建華課題組與李繼喜課題組合作,研究解析了非洲豬瘟病毒DNA修復(fù)通路上一種關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究成果在線發(fā)表于《自然·通訊》。

           這種關(guān)鍵酶是連接酶,被稱為基因“針線”,用于將不同的DNA片段連接起來。這次通過解析非洲豬瘟病毒DNA連接酶的分子機(jī)制,研究團(tuán)隊(duì)找到了非洲豬瘟病毒的保守位點(diǎn),為針對非洲豬瘟病毒DNA修復(fù)通路蛋白的藥物設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

           斷尾求生,病毒躲過宿主免疫系統(tǒng)

           “人們會發(fā)現(xiàn),患了豬瘟的病豬會發(fā)生脾 臟腫大,脾 臟是重要的免疫器官,那說明它的免疫系統(tǒng)‘奮力作戰(zhàn)’了。”李繼喜說,但是非洲豬瘟病毒很聰明,在進(jìn)入體內(nèi)后會不斷變化,讓免疫系統(tǒng)“抓不到”。

           它的變化很像壁虎的“斷尾求生”。“對于宿主免疫系統(tǒng)要攻擊的DNA片段,它會剪切掉,然后再重新‘長出來’。”李繼喜說。“長出來”意味著DNA的延長、重組,這個(gè)過程需要兩種DNA聚合酶(X和P)和一種DNA連接酶。

           “有這3種酶參與的整個(gè)過程形成了一套完整的DNA修復(fù)通路。”李繼喜說,團(tuán)隊(duì)已經(jīng)解出了其中的一種聚合酶,文章2017年發(fā)表,揭示了聚合酶X擁有一個(gè)獨(dú)特的磷酸根識別位點(diǎn);另一種聚合酶的研究已經(jīng)收尾,正在進(jìn)行結(jié)果整理和論文編寫工作,至此團(tuán)隊(duì)已經(jīng)“全面打通”整個(gè)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

           病毒更狡猾的地方在于它新長出來的DNA片段和原來的不同,使得宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)措手不及,難以鎖定攻擊目標(biāo)。非洲豬瘟病毒也是如此,其基因組修復(fù)時(shí)會發(fā)生突變,讓免疫系統(tǒng)無法精準(zhǔn)識別,進(jìn)而使得針對它們的狙擊,無法奏效。

           分辨率高,晶體法定格“繡娘”手法

           俗話說,“萬變不離其宗”。既然病毒DNA修復(fù)時(shí)有千變?nèi)f化,有沒有可能找到所謂的“宗”即保守區(qū)呢?

           這就要對關(guān)鍵酶進(jìn)行高精度的結(jié)構(gòu)解析。團(tuán)隊(duì)選擇了X-射線晶體學(xué)方法,與聲名鵲起的冷凍電鏡方法相比,前者的分辨率更高,且一旦摸索好條件后,更易重復(fù)。

           結(jié)晶條件的摸索卻是非常艱難的過程。“我們用基因工程的方法,讓非洲豬瘟病毒的連接酶在工程菌中大量表達(dá),通過純化柱等方法將蛋白純化出來。”李繼喜說。這個(gè)時(shí)候目標(biāo)蛋白還在溶液中,與同自己性質(zhì)、分子量相近的“兄弟姐妹”在一起。

           團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了上千次相關(guān)參數(shù)的摸索,最終得到了均一性高的**晶型,通過X光衍射、三維重構(gòu)等方法,獲得了分辨率達(dá)到2.5埃的連接酶分子結(jié)構(gòu)。

           在超高分辨率下,科學(xué)家可以看到蛋白質(zhì)中每個(gè)氨基酸單體的相互作用、電子密度云的情況,目擊氫鍵間的相互連接,從而判斷和預(yù)測作為“繡娘”的DNA連接酶將用哪些可能的針法將什么樣的DNA片段連接起來。

           親見“凹造型”,鎖定藥物設(shè)計(jì)潛力點(diǎn)

           預(yù)測之后,必須親見。利用X-射線晶體學(xué)方法獲取酶與DNA作用的“影像”,將對酶與底物相互作用時(shí)的“凹造型”一目了然。

           為此,根據(jù)已經(jīng)獲得的連接酶分子結(jié)構(gòu),參考相關(guān)文獻(xiàn),團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了10幾種可能的DNA片段,試試連接酶的“功力”。“DNA片段有長有短,含有的堿基對數(shù)量8到20個(gè)不等。”李繼喜說。

           對于這些不同的DNA底物分子,連接酶表現(xiàn)了不同的活性。從本質(zhì)上說,它們之間的反應(yīng)是酶促反應(yīng)。分析發(fā)現(xiàn),非洲豬瘟病毒連接酶在底物催化位點(diǎn)附近具有一些明顯不同的氨基酸組成。蛋白突變、體外DNA結(jié)合以及活性研究顯示,催化位點(diǎn)附近的氨基酸對其與DNA形成復(fù)合物及活性至關(guān)重要。

           李繼喜解釋道:“單獨(dú)的酶的構(gòu)象可以想象成一個(gè)三節(jié)棍,當(dāng)和DNA作用時(shí),這個(gè)三節(jié)棍的三段會發(fā)生變化,收攏到一起形成一個(gè)‘口袋’狀,把DNA關(guān)在里面,促成DNA連接反應(yīng)的進(jìn)行。”

           高分辨率結(jié)構(gòu)顯示,該連接酶在N-端具有一個(gè)獨(dú)特的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NTD),該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锝Y(jié)合十分重要。

           “這就好比‘口袋’入口的地方有個(gè)把門的,這個(gè)獨(dú)特的結(jié)合結(jié)構(gòu)域‘認(rèn)可’了,才能被連接酶納入到口袋中,促進(jìn)DNA的反應(yīng),如果這個(gè)‘把門’的不同意,就無法進(jìn)行DNA的‘縫合’工作。”李繼喜說。

           可以針對這個(gè)獨(dú)特的位點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物,阻斷連接酶的工作,進(jìn)而掌握抑制病毒的方法。“已有研究發(fā)現(xiàn)病毒的成熟顆粒中含有連接酶,也就是說病毒已經(jīng)進(jìn)入了宿主細(xì)胞,并進(jìn)行了翻譯和組裝之后,才會啟動連接酶的翻譯工作。”李繼喜說,因此以該位點(diǎn)為靶點(diǎn)的藥物并不能預(yù)防非洲豬瘟的感染,而是對豬瘟進(jìn)行治療。目前,該團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開始與北大團(tuán)隊(duì)合作開啟化合物的篩選工作。

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